對潮霉素B Hygromycin B的抗性基因：

　　對潮霉素B的抗性源自編碼潮霉素B磷酸轉移酶(Hph)的基因。至今發(fā)現兩種來源：

　　1.Streptomyces hygroscopicus產生的Hph抗性基因;

　　2.Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae內質粒攜帶的Hph抗性基因(常用);

　　潮霉素B Hygromycin B的生物應用：

　　1) 篩選和維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉染Hph+載體的原核細胞或真核細胞(植物細胞和哺乳動物細胞);

　　2) 由于作用模式的差異，常與G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和blasticidin S聯合使用，篩選穩(wěn)定轉染兩個不同載體的細胞株;

　　3)抗病毒劑，由于潮霉素B選擇性滲透進入病毒感染增強通透性的細胞，而且具有抑制翻譯的功效;

　　4)作為驅蟲藥加入動物飼料;

　　應用濃度：

　　潮霉素B用來篩選穩(wěn)轉株的工作濃度需要根據細胞類型，培養(yǎng)基，生長條件和細胞代謝率而變化。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL，濃度需要殺滅曲線來確定。

　　哺乳動物細胞·200-500 μg/mL;細菌/植物細胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000 μg/mL;

　　潮霉素B Hygromycin B的兩種使用方法如下：

　　使用一：殺滅曲線確定殺死濃度(僅作參考，因個人檢測體系而異)

　　(1)往組織培養(yǎng)級的96孔板內加入未轉染細胞，細胞密度約50-200細胞/孔;細胞貼壁之后，往每孔加入含不同濃度(如50-1000μg/mL，至少5個濃度)潮霉素B的200μL新鮮培養(yǎng)基;

　　(2)37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細胞10-14天;

　　(3)培養(yǎng)5-7天后更換新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內含有相應濃度的潮霉素B;

　　(4)10-14天后使用細胞增殖方法如MTT，CCK-8等評估細胞活力;也可以通過檢測細胞克隆數或百分比匯合率來確定毒性效應。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細胞的小濃度為篩選濃度。

　　使用二：篩選穩(wěn)定轉染細胞

　　(1) 對于貼壁細胞，直接吸去60mm培養(yǎng)皿內的轉染細胞培養(yǎng)基，然后加入含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基5-6ml;對于懸浮細胞，無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉染細胞培養(yǎng)基，然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;

　　(2) 5-7天后，如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;

　　(3) 再孵育細胞5-7天;

　　(4) 10-14天孵育后，培養(yǎng)體系中只含有能夠表達潮霉素B抗性表型的活細胞。因此篩選之后如步驟一，更換不含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基。