大腸桿菌電轉感受態細胞 表達分析

DH5α-m Electrocompetent Cell

大腸桿菌電轉感受態細胞

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菌株描述

DH5α-m是兼容DH5α和DH10B菌株優點的一款克隆菌株，在其基因組中引入mcrA、mcrBC、mrr-、hsdRMS突變，使得從外源攝入的甲基化DNA不被降解，從而利于甲基化DNA的克隆和擴繁，特別適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA，同時提高了電轉效率。recA1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。lacZΔM15的存在使其可用于藍、白斑篩選。

DH5α-m菌株基因型：F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA mcrA Δ(mrr- hsdRMS-mcrBC)

產品描述

本品是大腸桿菌DH5α-m菌株經特殊工藝制作所得的電擊感受態細胞，只能用于DNA的電擊轉化，不能用于熱激轉化。經pUC19質粒檢測轉化效率＞2×10¹⁰ cfu/μg DNA。且在-80℃能穩定保存幾個月轉化效率不發生改變。

產品包裝

保存與運輸條件：

保存：-80℃保存，六個月有效。其中，組分C（S.O.C. Medium）+4℃保存。

運輸：干冰運輸。

注意事項

1）   感受態細胞最好保存在-80℃以下，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態細胞的轉化效率。

2）   整個轉化操作，嚴格根據相應溫度及無菌條件要求進行。

3）   加入DNA的體積不應大于感受態體積的1/10。DNA不純或存在鹽、乙醇、蛋白及緩沖液等污染時，會導致轉化效率急劇下降。

4）   為確保最高轉化效率，整個操作過程應盡量輕柔，并保持低溫。

5）   電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。

6）   電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

7）   若轉化大質粒或想獲得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

8）   對于連接產物轉化：最好在轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液重懸產物，保證DNA濃度不超過100ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。

9）   混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態細胞時不可用孔徑過小的槍頭（普通200μl槍頭應剪去槍頭尖0.6cm）。避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質粒或連接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

10）  為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無菌條件的標準下進行】

【準備工作】：根據每管（50μl）電擊感受態需10ml S.O.C.培養基的比例，提前將適量的S.O.C.培養基置于37℃預熱1-2h。

1）將0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈吸水紙上5min，待其瀝干水分，正置5min，使乙醇充分揮發干凈，立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5min使其充分降溫。

2）取-80℃保存的電擊感受態細胞插入冰中5min，待其完quan融化。加入目的DNA（質粒或連接產物），用手bo打管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。

【注意】：要測定轉化效率，請使用1μl pUC19 Control Vector (10pg/μl)。

【注意】：對于連接產物，部分公司的T4連接酶體系或重組體系不用純化，可直接與電轉感受態細胞混合后進行電擊轉化，需控制DNA濃度≤100ng/μl，體積≤5μl/50μl感受態細胞。

【注意】：對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系需用膜純化或乙醇沉淀DNA后加入適量ddH2O重懸，然后與電擊感受態細胞混合進行電擊轉化，需控制DNA濃度≤100ng/μl，體積≤5μl/50μl感受態細胞。

3）用200μl槍頭（注意所用的槍頭用剪刀剪掉0.5cm尖頭）輕輕吹打混勻感受態細胞-DNA之后快速轉移到電擊杯中，避免產生氣泡，輕輕晃動使液面保持水平狀態，蓋上杯蓋，插入冰中。

4）啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV（此參數參考Bio-rad，具體使用請參考電轉儀推薦參數來操作），將電擊杯從冰中拿出，用吸水紙擦拭表面，吸干表面水漬，放入電轉槽中，電擊完成后，拿出電轉杯放室溫。

5）打開杯蓋，15s內加入900 μl無抗生素的無菌S.O.C.培養基（已預熱），用1ml槍吹吸電擊杯底部2-3次，混勻后轉移到50ml離心管，向離心管內補加S.O.C.培養基定容至10ml。于37℃，225rpm振蕩復蘇培養1h。

6）5,000rpm離心1min收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C.平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑150mm培養皿2~5個），用無菌玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，37℃過夜培養13~17h。

【注意】：后續若想獲得大量高純度質粒，建議在TB培養基中于37℃搖菌培養，以對照質粒pUC19為為例，在TB培養基中過夜培養的菌體濃度和質粒產量，約是LB培養基的3-4倍，約是SOB培養基的2倍。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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